Didattica di Scienze

Clonaggio di un gene

Esercitazione presso la FARMM per 5 studenti dell'Istituto che hanno frequentato il BIOFORM
1° corso 19-20-21 settembre
2° corso il 5-6-7 ottobre

In queste esercitazioni vengono mostrate e fatte provare le tecniche quotidianamente utilizzate nei laboratori di ricerca per identificare la funzione dei geni e per sintetizzare farmaci ricombinanti.
L’attività prevede il trasferimento di un gene codificante la proteina GFP (Green Fluorescent Protein) all’interno di batteri E.Coli per la sua amplificazione (“clonaggio”). L’esperienza si basa sul principio che il DNA è uguale in tutti gli organismi viventi, dai batteri all’uomo: pertanto è possibile trasferire un gene da una specie ad un’altra ottenendo lo stesso prodotto proteico, in questo caso la proteina fluorescente GFP, che emette luce verde quando esposta a radiazioni UV. Allo stesso tempo i batteri, moltiplicandosi, replicano il gene inserito in numerose copie.
Gli studenti isoleranno il gene per la GFP utilizzando gli enzimi di restrizione appropriati e lo purificheranno mediante la tecnica di elettroforesi su gel di agarosio, che permette di identificare la presenza di specifici frammenti di DNA determinandone la dimensione.
Inseriranno quindi il gene d’interesse in un vettore plasmidico, ovvero una sequenza di DNA in grado di trasportare e far sintetizzare il gene all’interno dei batteri. Il vettore sarà poi introdotto nei batteri, e questi seminati su piastre con o senza selezione antibiotico: l’antibiotico permetterà la crescita solo ai batteri modificati.

Green Fluorescent Protein

Il fenomeno che permette di vedere gli oggetti al buio può essere chiamato FLUORESCENZA o FOSFORESCENZA e ciò dipende dalle caratteristiche delle sostanze sostanze chimiche che compongono il materiale che brilla al buio.

Semplificando al massimo possiamo dire che alcune sostanze, quando sono sottoposte all'azione della luce, riemettono le radiazioni ricevute ma su una banda di lunghezza d'onda più bassa.

Nella fluorescenza questo processo si interrompe appena la luce viene a mancare, come per il tratto degli evidenziatori che è molto brillante alla luce ma non si vede al buio.

Nella fosforescenza, invece,l'effetto continua per un po' anche al buio, come nel caso dei braccialetti.

In natura esiste anche una proteina verde fluorescente. Nel 1961 il ricercatore Osamu Shimomura, del Laboratorio Biologico Marino del Massachusetts, notò in una medusa una molecola che brillava di una luce verde chiara se esposta ai raggi ultravioletti.

Studiò lungamente le molecole luminose e trovò la proteina che crea la fluorescenza (GFP) che venne poi usata per individuare processi nelle cellule e per marcarle. Nel 2008 il lavoro di Shimomura e dei suoi colleghi fu riconosciuto con il premio Nobel.

Nella GFP il fluoroforo ha origini nella sequenza Ser-Tyr-Gly che viene post-tradotta a 4-(p-hydroxybenzylidene)- imidazolidin-5-one. Il fluoroforo in sè è un p-hydroxybenzylidene-imidazolidone che consiste di residui Ser65- dehydroTyr66 - Gly67 della proteina il quale scheletro ciclico forma l'imidazolidone. La fluorescenza non è una fluorescenza intrinseca del tripeptide Ser-Tyr-Gly ma questa è dovuta probabilmente a due ragioni:
- una parziale carica negativa sull'ossigeno benzile della Tyr
- una carica sull'ossigeno carbonile dell'anello imidazolidonico
Nella struttura a 3D della GFP alcuni residui basici formano legami H con ognuno di questi atomi di ossigeno e in particolare:
- His148 con Tyr66
- Gln94 e Arg96 con l'imidazolidone
Questi residui basici agiscono per stabilizzare e successivamente delocalizzare la carica sul fluoroforo. Il fluoroforo è generato da un meccanismo sequenziale in un processo autocatalitico. Non sono richiesti cofattori o componenti enzimatici. La reazione ha inizio con una rapida ciclizzazione tra Ser65 e Gly67 a formare un intermediario imidazolin-5-one seguito da una più lenta ossigenazione della Tyr66 della catena laterale da un O2 della durata di alcune ore. Solo la Gly67 è richiesta per la formazione del fluoroforo e nessun altro aminoacido può sostituire la Gly in questo ruolo. La reazione è termosensibile. La capacità di formazione del fluoroforo decresce con l'aumentare della temperatura in particolare al di sopra dei 30°C. Una volta formata, la GFP è abbastanza termostabile

Notizie pratiche per il corso

5 ottobre - mattina
6 ottobre - pomeriggio
7 ottobre - mattina

Modalità di pagamento per le esercitazione degli studenti dello stage "Clonaggio e purificazione della proteina GFP"
Costo dell'esercitazione: € 35 per studente (NB: non saranno presenti i propri docenti)
I pagamenti possono essere effettuati preferibilmente mediante Bonifico bancario intestato a
FARMM onlus
IBAN IT60T0100503225000000015451
oppure pagamento in contanti al momento dell'esercitazione con rilascio di ricevuta.

I laboratori CNR-EBRI sono ubicati in Via del Fosso di Fiorano 64. I laboratori sono raggiungibili con la linea 761 prolungata, che è attiva con il seguente orario:

LINEA 761 ANDATA PROLUNGATA
06.54 07.30 07.48 08.06 08.24 08.42 09.00 09.17 09.34 09.51 10.08 10.25 13.03 14.15 14.36 16.30 16.52 17.15 17.37 18.00 18.22 18.45 19.07
riccardi , ostiense/efeso , ostiense/valco s.paolo , laurentina/farfa , laurentina/gibilmanna , laurentina/colombo , laurentina/ardigo' , laurentina/tre fontane , laurentina/mendoza , laurentina/serafico , laurentina metro ,laurentina/africa , laurentina/lorenzoni , laurentina/sommozzatori , laurentina/genieri , esercito/cecchignola ,esercito/mitraglieri , esercito/arditi , esercito/artiglieri , esercito/chiesa del presidio ,esercito/fucilieri , esercito/centro direzionale , esercito/carabinieri , tor pagnotta/cecchignola , tor pagnotta/civico 304 , fosso di fiorano/ebri , casali romagnoli/ebri

LINEA 761 RITORNO PROLUNGATA
07.28 08.17 08.36 08.53 09.10 09.27 09.44 10.00 10.16 10.32 10.48 11.06 13.45 14.56 15.17 17.15 17.37 18.00 18.22 18.45 19.07 19.30 19.52
casali romagnoli/ebri , tor pagnotta/bel poggio , tor pagnotta/civico 304 , tor pagnotta/cecchignola , carabinieri , esercito/fucilieri , esercito/chiesa del presidio , esercito/artiglieri , esercito/mitraglieri , laurentina/cecchignola , laurentina/genieri , laurentina/sommozzatori , laurentina/lorenzoni , laurentina/africa , laurentina metro ,laurentina/serafico , laurentina/mendoza , laurentina/trefontane , laurentina/ardigo' , laurentina/colombo , marconi/gibilmanna , marconi , marconi/pincherle , efeso , ostiense/efeso , ostiense/tessalonica , riccardi

In evidenza le fermate in coincidenza con la Metro B e gli orari utili per raggiungere in tempo i laboratori e per la partenza dagli stessi al termine delle esercitazioni.